|
人白细胞分化抗原14定量酶联检测试剂盒使用说明
人白细胞分化抗原14定量酶联检测试剂盒使用说明
【原理】
本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗人CD14单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的人CD14与单抗结合，加入生物素化的抗人CD14抗体，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm处测OD值，人CD14浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中人CD14浓度。
【试剂盒组成】
1. 酶标板：一块（96孔/48孔），已包被抗人CD14单抗。
2. 样品稀释液：一瓶（5ml/10ml）
3. 第一抗体工作液：一瓶（5.5ml/2.7ml）
4. 酶标抗体工作液：一瓶（10.5ml/5.5ml）
5. 底物稀释液：一瓶（15ml/10.5ml）
6. 终止液：一瓶（6ml/3ml）
7. 洗涤液（20 x）：一瓶（50ml/25ml）
8. 标准品（冻干粉，4000 pg/ml）：二管/一管
9. OPD片：三片/二片
10. 坐标纸：一张
11. 封板纸：一张
【样品的准备和保存】
样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。
1. 血清：用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心1000×g 15分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
2. 血浆：采用EDTA抗凝，抽血后30分钟内离心1000×g 15分钟。立即分析或分 装后-20℃冷冻保存。
3. 细胞培养、组织匀浆、体液：离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
【试剂的准备】
1. 标准品液配制：使用前每管中加入蒸馏水200ul溶解后即可。
2. 洗涤液：用重蒸水1:20稀释
3. 底物工作液配制：显色前5-10分钟将OPD片放入底物稀释液中溶解，每片加液5ml。
【检测程序】
1. 实验前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温（20-25℃）。
2. 取出所需数量的板条，其余密封放回4℃。
3. 建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100ul，第一孔加标准品100ul，混匀后用加样器吸出100ul，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔,最后，从第七孔中吸出100ul弃去，使之体积均为100ul。第八孔为空白对照。
4. 加样：待测品孔每孔中各加入样品稀释液80 ul，血清标本20 ul。
5. 将反应板置37℃120分钟。
6. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
7. 每孔中加入第一抗体工作液50ul。
8.将反应板充分混匀后置37℃ 60分钟。
9. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
10. 每孔加酶标抗体工作液100ul。
11. 将反应板置37 ℃60分钟。
12. 洗板：同前。
13. 每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应5-10分钟。
14. 每孔加入50ul终止液混匀。
15. 在492nm处测吸光值。（应尽快，时间过长可能导致本底偏高）
【结果计算与判断】
1. 所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2. 以准品4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 pg/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。将浓度作为X轴（对数轴），OD值作为Y轴（线性轴）。曲线应为一光滑曲线。
3. 根据样品OD值在该曲线图上查出相应人CD14含量。
【注意事项】
1. 以上标准孔及待查样品均建议做复孔，每次测定应同时制作标准曲线
2. 底物工作液应现配现用，若溶液颜色发黄则已失效，弃去。
3. 本试剂盒取出的试剂在室温条件下使用，溶液应轻轻摇匀后使用。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，这属于正常现象，加热使结晶完全溶解后再配制。
4. 本试剂盒含2M硫酸，不要将它与含叠氮化钠的废物混在一起。
5. 板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。
6. 不同批号的试剂盒组份不能混用。
7. 正确拿酶标板：不要接触板的底部，否则会影响读数。
【贮存】
本试剂盒宜置-20℃冷冻，可保存半年。若试剂盒开封后短期内做完（一个月内），可置4℃冷藏保存。
【性能参数】
灵敏度：最小可测人CD14达32 pg/ml。
重复性：板内变异系数<10%。
板间变异系数<15%。
|
您当前位置：首页 > 技术资料 > 全部技术资料