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人I型胶原定量酶联检测试剂盒使用说明书
人I型胶原定量酶联检测试剂盒使用说明书
【测定原理】
本试剂盒采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人I型胶原单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的人I型胶原与单抗结合，加入生物素化抗人I型胶原多抗，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的生物素抗体与之结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm处测OD值，人I型胶原浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中人I型胶原浓度。
【试剂盒组成】
1. 酶标板：一块（96孔/48孔），已包被抗人I型胶原单抗。
2. 样品稀释液：一瓶（5ml）
3. 第一抗体工作液：一瓶（5.5ml/2.7ml）
4. 酶标抗体工作液：一（10.5ml/5.5ml）
5. 底物稀释液：一（15ml/10.5ml）
6. 终止液：一（6ml/3ml）
7.洗涤液（20 x）一瓶(50ml/25ml）
8. 标准品（液体，4000 ng/ml）：管
9. OPD片：三片/二片
10. 坐标纸：张
11. 封板纸：一张
【样品的准备和保存】
样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。
1. 血清：用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心1000×g 15分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
2. 血浆：采用EDTA抗凝，抽血后30分钟内离心1000×g 15分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
3. 细胞培养、组织匀浆、体液：离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
【试剂的准备】
1. 洗涤液：用重蒸水1:20稀释
2. 底物工作液配制：显色前5-10分钟将OPD片放入底物稀释液中溶解，每片加液5ml。
【操作步骤】
1. 实验前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温（20-25℃）。
2. 建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100ul，第一孔加标准品100ul，混匀后用加样器吸出100ul，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100ul弃去，使之体积均为100ul。第八孔为空白对照。
3. 加样：待测品孔中每孔各加入待测样品100ul。
4. 将反应板置37℃120分钟。
5. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
6. 每孔中加入第一抗体工作液50ul。
7. 将反应板充分混匀后置37℃ 60分钟。
8. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
9. 每孔加酶标抗体工作液100ul。
10. 将反应板置37 ℃60分钟。
11. 洗板：同前。
12. 每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应5-10分钟。
13. 每孔加入50ul终止液混匀。
14. 在492nm处测吸光值。（应尽快，时间过长可能导致本底偏高）
【结果判断】
1. 所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2. 以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0 ng/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。将浓度作为X轴（对数轴），OD值作为Y轴（线性轴）。曲线应为一光滑曲线。
3. 根据样品OD值在该曲线图上查出相应人I型胶原含量。
【注意事项】
1. 以上标准孔及待查样品均建议做复孔，每次测定应同时制作标准曲线。
2. 底物工作液应现配现用，若溶液颜色发黄则已失效，弃去。
3. 本试剂盒取出的试剂在室温条件下使用，溶液应轻轻摇匀后使用。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，这属于正常现象，加热使结晶完全溶解后再配制。
4. 本试剂盒含2M硫酸，不要将它与含叠氮化钠的废物混在一起。
5. 不同批号的试剂盒组份不能混用。
6. 正确拿酶标板：不要接触板的底部，否则会影响读数。
【有效期及贮存条件】
本试剂盒宜置4℃冷冻，可保存三个月。
【性能参数】
灵敏度：最小可测人I型胶原达16 ng/ml。
重复性：板内变异系数<10%。
板间变异系数<15%。
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