【原理】

本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗人EGF单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的人EGF与单抗结合，加入生物素化的抗人EGF抗体，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm处测OD值，人EGF浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中人EGF浓度

【试剂盒组成】

1.        酶标板：一块（96孔/48孔），已包被抗人EGF单抗。

2.        样品稀释液：一瓶（5ml/10ml）

3.        第一抗体工作液：一瓶（5.5ml/2.7ml）

4.        酶标抗体工作液：一瓶（10.5ml/5.5ml）

5.        底物稀释液：一瓶（15ml/10.5ml）

6.        终止液：一瓶（6ml/3ml）

7.        洗涤液（20 x）：一瓶（50ml/25ml）

8.        标准品（冻干粉，4000 pg/ml）：二管/一管

9.        OPD片：三片/二片

10.   坐标纸：一张

11.   封板纸：一张

【样品的准备和保存】

   样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。

1.      血清：用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心1000×g 15分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

2.      血浆：采用EDTA抗凝，抽血后30分钟内离心1000×g 15分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

3.      细胞培养、组织匀浆、体液：离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

 【试剂的准备】

1.        标准品液配制：使用前每管中加入蒸馏水200ul溶解后即可。

2.        洗涤液：用重蒸水1:20稀释

3.        底物工作液配制：显色前5-10分钟将OPD片放入底物稀释液中溶解，每片加液5ml。

 【检测程序】

1.        实验前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温（20-25℃）。

2.        取出所需数量的板条，其余密封放回4℃。

3.        建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100ul，第一孔加标准品100ul，混匀后用加样器吸出100ul，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100ul弃去，使之体积均为100ul。第八孔为空白对照。

4.        加样：待测品孔每孔中各加入样品稀释液50 ul，血清标本50 ul。

5.        将反应板置37℃120分钟。

6.        洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

7.        每孔中加入第一抗体工作液50ul。

8.        将反应板充分混匀后置37℃ 60分钟。

9.        洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

10.   每孔加酶标抗体工作液100ul。

11.   将反应板置37 ℃60分钟。

12.   洗板：同前。

13.   每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应5-10分钟。

14.   每孔加入50ul终止液混匀。

15.   在492nm处测吸光值。（应尽快，时间过长可能导致本底偏高）

 【结果计算与判断】

1.        所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.        以标准品4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 pg/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。将浓度作为X轴（对数轴），OD值作为Y轴（线性轴）。曲线应为一光滑曲线。

3.        根据样品OD值在该曲线图上查出相应人EGF含量。

 【注意事项】

1.        以上标准孔及待查样品均建议做复孔，每次测定应同时制作标准曲线。

2.        底物工作液应现配现用，若溶液颜色发黄则已失效，弃去。

3.        本试剂盒取出的试剂在室温条件下使用，溶液应轻轻摇匀后使用。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，这属于正常现象，加热使结晶完全溶解后再配制。

4.        本试剂盒含2M硫酸，不要将它与含叠氮化钠的废物混在一起。

5.        板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。

6.        不同批号的试剂盒组份不能混用。

7.        正确拿酶标板：不要接触板的底部，否则会影响读数。

 【贮存】

本试剂盒宜置-20℃冷冻，可保存半年。若试剂盒开封后短期内做完（一个月内），可置4℃冷藏保存。

 【性能参数】

灵敏度：最小可测人EGF达32 pg/ml。

重复性：板内变异系数<10%。

　　　　板间变异系数<15%。