人I型前胶原肽(N端)定量酶联检测试剂盒
人I型前胶原肽(N端)定量酶联检测试剂盒
使用说明书
【测定原理】
本试剂盒采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人PINP单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的人PINP与单抗结合,加入生物素化抗人PINP多抗,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的生物素抗体与之结合,加入酶底物OPD,出现黄色,加终止液硫酸,颜色变深,在492nm处测OD值,人PINP浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中人PINP浓度。
【试剂盒组成】
1. 酶标板:一块(96孔/48孔),已包被抗人PINP单抗。
2. 样品稀释液:一瓶(5ml)
3. 第一抗体工作液:一瓶(5.5ml/2.7ml)
4. 酶标抗体工作液:一瓶(10.5ml/5.5ml)
5. 底物稀释液:一瓶(15ml/10.5ml)
6. 终止液:一瓶(6ml/3ml)
7. 洗涤液(20 x):一瓶(50ml/25ml)
8. 标准品(液体,1000 ng/ml):一管
9. OPD片:三片/二片
10. 坐标纸:一张
11. 封板纸:一张
【样品的准备和保存】
样品如果不立即分析,应分装后冷冻保存,且避免反复冻融。
1. 血清:用干净试管收集血液,室温凝固30分钟,离心1000×g 15分钟,收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
2. 血浆:采用EDTA抗凝,抽血后30分钟内离心1000×g 15分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
3. 细胞培养、组织匀浆、体液:离心去除沉淀,立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
【试剂的准备】
1. 洗涤液:用重蒸水1:20稀释
2. 底物工作液配制:显色前5-10分钟将OPD片放入底物稀释液中溶解,每片加液5ml。
【操作步骤】
1. 实验前20分钟从冰箱中取出试剂盒,以平衡至室温(20-25℃)。
2. 建立标准曲线:设标准孔8孔,每孔中各加入样品稀释液100ul,第一孔加标准品100ul,混匀后用加样器吸出100ul,移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔,最后,从第七孔中吸出100ul弃去,使之体积均为100ul。第八孔为空白对照。
3. 加样:待测品孔中每孔各加入待测样品100ul。
4. 将反应板置37℃120分钟。
5. 洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。
6. 每孔中加入第一抗体工作液50ul。
7. 将反应板充分混匀后置37℃ 60分钟。
8. 洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。
9. 每孔加酶标抗体工作液100ul。
10. 将反应板置37 ℃60分钟。
11. 洗板:同前。
12. 每孔加入底物工作液100ul,置37℃暗处反应5-10分钟。
13. 每孔加入50ul终止液混匀。
14. 在492nm处测吸光值。(应尽快,时间过长可能导致本底偏高)
【结果判断】
1. 所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2. 以标准品500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、0 ng/ml之OD值在半对数纸上作图,画出标准曲线。将浓度作为X轴(对数轴),OD值作为Y轴(线性轴)。曲线应为一光滑曲线。
3. 根据样品OD值在该曲线图上查出相应人PINP含量。
【注意事项】
1. 以上标准孔及待查样品均建议做复孔,每次测定应同时制作标准曲线。
2. 底物工作液应现配现用,若溶液颜色发黄则已失效,弃去。
3. 本试剂盒取出的试剂在室温条件下使用,溶液应轻轻摇匀后使用。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,这属于正常现象,加热使结晶完全溶解后再配制。
4. 本试剂盒含2M硫酸,不要将它与含叠氮化钠的废物混在一起。
5. 不同批号的试剂盒组份不能混用。
6. 正确拿酶标板:不要接触板的底部,否则会影响读数。
【有效期及贮存条件】
本试剂盒宜置-20℃冷冻,可保存半年。若试剂盒开封后短期内做完(一个月内),可置4℃冷藏保存。
【性能参数】
灵敏度:最小可测人PINP达4 ng/ml。
重复性:板内变异系数<10%。
板间变异系数<15%。
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