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人金属基质蛋白酶组织抑制因子-1定量酶联检测试剂盒


人金属基质蛋白酶组织抑制因子-1定量酶联检测试剂盒
使用说明书
【原理】
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人TIMP-1单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的人TIMP-1与单抗结合,加入生物素化的抗人TIMP-1抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入酶底物OPD,出现黄色,加终止液硫酸,颜色变深,在492nm处测OD值,人TIMP-1浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中人TIMP-1浓度。
 
【试剂盒组成】
1.        酶标板:一块(96孔/48孔),已包被抗人TIMP-1单抗。
2.        样品稀释液:一瓶(5ml/10ml)
3.        第一抗体工作液:一瓶(5.5ml /2.7ml)
4.        酶标抗体工作液:一瓶(10.5ml/5.5ml)
5.        底物稀释液:一瓶(15ml/10.5ml)
6.        终止液:一瓶(6ml/3ml)
7.        洗涤液(20 x):一瓶(50ml/25ml)
8.        标准品(冻干粉,100 ng/ml):二管/一管
9.        OPD片:三片/二片
10.   坐标纸:一张
11.   封板纸:一张
 
样品的准备和保存
样品如果不立即分析,应分装后冷冻保存,且避免反复冻融。
1.      血清:用干净试管收集血液,室温凝固30分钟,离心1000×g 15分钟,收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
2.      血浆:采用EDTA抗凝,抽血后30分钟内离心1000×g 15分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
3.      细胞培养、组织匀浆、体液:离心去除沉淀,立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
 
【试剂的准备】
1.        标准品液配制:使用前每管中加入蒸馏水200ul溶解后即可。
2.        洗涤液:用重蒸水1:20稀释
3.        底物工作液配制:显色前5-10分钟将OPD片放入底物稀释液中溶解,每片加液5ml。
 
【检测程序】
1.        实验前20分钟从冰箱中取出试剂盒,以平衡至室温(20-25℃)。
2.        取出所需数量的板条,其余密封放回4℃。
3.        建立标准曲线:设标准孔8孔,每孔中各加入样品稀释液100ul,第一孔加标准品100ul,混匀后用加样器吸出100ul,移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔,最后,从第七孔中吸出100ul弃去,使之体积均为100ul。第八孔为空白对照。
4.        加样:待测品孔每孔中各加入样品稀释液98 ul,血清标本2 ul。(即将标本进行1:50稀释)
5.        将反应板置37℃120分钟。
6.        洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。
7.        每孔中加入第一抗体工作液50ul。
8.        将反应板充分混匀后置37℃ 60分钟。
9.        洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。
10.   每孔加酶标抗体工作液100ul。
11.   将反应板置37 ℃60分钟。
12.   洗板:同前。
13.   每孔加入底物工作液100ul,置37℃暗处反应5-10分钟。
14.   每孔加入50ul终止液混匀。
15.   在492nm处测吸光值。(应尽快,时间过长可能导致本底偏高)
 
【结果计算与判断】
1.        所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2.        以标准品50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0 ng/ml之OD值在半对数纸上作图,画出标准曲线。将浓度作为X轴(对数轴),OD值作为Y轴(线性轴)。曲线应为一光滑曲线。
3.        根据样品OD值在该曲线图上查出相应人TIMP-1含量。(此时所查出的TIMP-1量为50倍稀释后的浓度值,因此还须再乘以50,即为TIMP-1浓度值。)
 
【注意事项】
1.        以上标准孔及待查样品均建议做复孔,每次测定应同时制作标准曲线。
2.        底物工作液应现配现用,若溶液颜色发黄则已失效,弃去。
3.        本试剂盒取出的试剂在室温条件下使用,溶液应轻轻摇匀后使用。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,这属于正常现象,加热使结晶完全溶解后再配制。
4.        本试剂盒含2M硫酸,不要将它与含叠氮化钠的废物混在一起。
5.        板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥。
6.        不同批号的试剂盒组份不能混用。
7.        正确拿酶标板:不要接触板的底部,否则会影响读数。
 
【贮存】
本试剂盒宜置-20℃冷冻,可保存半年。若试剂盒开封后短期内做完(一个月内),可置4℃冷藏保存。
 
【性能参数】
灵敏度:最小可测人TIMP-1达0.4 ng/ml。
重复性:板内变异系数<10%。
    板间变异系数<15%
 
 

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