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琼脂糖凝胶纯化回收


琼脂糖凝胶纯化回收

问题与解决方法

问题
评论与建议
 
核酸产量低
或者纯度不高
*试剂盒储存在非最佳条件-建议:收到试剂盒后总是存放在室温(15℃-20℃)。
*缓冲液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下-建议:储存在室温(15℃-20℃),每次用完后立刻盖紧盖子,以免溶液蒸发,pH改变和污染。
*漂洗液WB中忘记加无水乙醇-建议:第一次实验时,在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇。
*试剂和要回收溶液如PCR产物没有充分混匀-建议:加入每个试剂后都要充分混匀。
洗脱后
回收率低
*使用了非最佳的洗脱液,洗脱液的高pH非常重要-建议:不要用水洗脱,用试剂盒带的洗脱液EB.。
回收后DNA
下游酶切不能
切开或者
酶切不完全
*忘记做步骤9,乙醇抑制了酶切反应-建议:做步骤9,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用,
纯化的DNA
产物OD260
数值异常偏高
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了分光光度计读数-建议:将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。
洗脱液中
不含DNA
*在初始处理材料中没有PCR产物-建议:开始回收前,用琼脂糖凝胶/EB电泳检测PCR产物。
回收后DNA
的浓度太低
*起始的处理材料中DNA含量太低-建议:加大处理量和减少洗脱液的体积,但注意不要少于30μl。
*回收的片段小于100bp或者大于10kb -建议:片段小于100bp或者大于10kb回收效率都会迅速降低,可尝试提高起始处理量。
回收产量不高
*洗脱不完全-建议:可使用2次洗脱缓冲液EB洗脱(每次30μl),合并两次洗脱液。
 
 

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