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血液基因组DNA提取


 血液基因组DNA提取

◆ 问题与解决方法

问题
评论与建议
标本中
含有血凝块
*不恰当的存放标本,未充分混匀,未使用合适的抗凝剂-建议:丢弃有血凝块的标本,重新用EDTA,肝素,柠檬酸剂收集血液。
红细胞裂解
不完全
*血液标本裂解前没有回复到室温-建议:处理前先把血液标本回复到室温。
*裂解时间不够-建议:可延长裂解时间至15分钟以上。
*裂解过程中没有混匀-建议:裂解过程中可以更多次颠倒混匀,或者轻弹管壁帮助裂解。
DNA产量低
*血液标本中本身含有的白细胞数量低-建议:增加起始血液处理量。
*血液标本存放时间太长-建议:存放在4℃的血液标本超过5天的产量可能大大降低,因此不要存放太久。
*蛋白酶K失效了-建议:收到蛋白酶K后,按照每次使用量分装冻存,避免反复冻融。
*裂解不完全或者和异丙醇没有充分混匀-建议:加入结合液后,和加入蛋白酶K后立即吹打或者涡旋混匀;加入异丙醇后立即吹打或者涡旋混匀才加入吸附柱,如果太粘稠必须涡旋振荡15秒充分混匀。
*洗脱效率不高-建议:确保做了步骤8,否则残留乙醇会影响洗脱效率,仔细阅读仔细阅读注意事项6和步骤9和只使用洗脱缓冲液EB洗脱。
DNA下游酶切
不能切开或者
酶切不完全
*忘记做步骤8,乙醇抑制了酶切反应-建议:做步骤8,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。
DNA长度
小于15kb
*血液样品太老或者不正确的存放,造成DNA降解-建议:选用新鲜的血液样品
*操作不当,造成对基因组DNA的剪切-建议:混匀时不可太剧烈,不可以用手剧烈振荡离心管,选用大口径的枪头转移或者混匀DNA。
A260吸光值
异常偏高
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了吸光值-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。
洗脱下来的
DNA
溶液还带有轻微的颜色
*漂洗不完全-建议:1. 漂洗,直到离心下来的液体没有颜色;2. 将洗脱液当成起始材料,再重复一遍实验,注意略去蛋白酶K消化和70℃孵育步骤。
 
 

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