线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒 描述： 线粒体参与能量代谢过程，参与细胞凋亡与老化等信号转导过程，参与退行性疾病如  帕金森氏病，肿瘤等病理过程。线粒体/胞浆分离试剂盒 (Mitochondria Isolation Kit)用于从组织或培养细胞中分离线粒体和胞浆成分。加入缓冲液匀浆破碎组织或培养细胞，经过数次800g和12000g离心，在60分钟内即可分离出完整的线粒体和胞浆成分。用于Western Blot、2D-胶、ELISA、酶学测定、线粒体蛋白或DNA提取、蛋白质组学等研究。 组成： Mito-Cyto Isolation Buffer 90 ml/50 preparation, 180 ml/100 preparation。 储存： 短期4 ºC，长期-20 ºC。 适用： 从组织、培养细胞制备线粒体。 制备程序：    1. a. 组织匀浆：称取50-200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS冲洗，用剪刀          剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。估计组织块总体积。加入1.5 ml冰预冷的Mito-Cyto Buffer。上下研磨组织20次。 b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 × g 5~10 min离心收集细胞。计数。每次提取需要5 × 107个细胞。加入1.5 ml冰预冷的Mito-Cyto Buffer重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内。用间隙严密的研杵研磨细胞30-40次。 2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管。800 × g 离心5 min 4 ºC。细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底。 3. 收集上清液并转移到新的离心管。800 × g 离心5 min at 4 ºC。弃沉淀 4. 将上清液转移到新的离心管。12,000 × g 离心10 min 4 ºC。离心后的上清含胞浆成分，将上清转移到新离心管。线粒体沉淀在管底。 5. 洗涤线粒体：清除管内壁粘连的液体和碎片，加入0.2 ml Mito-Cyto Buffer重悬线粒体沉淀，12,000 × g 离心10 min 4 ºC。弃上清。 6. 用Mito-Cyto Buffer或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，50 µl/每100 mg组织，100 µl/5 × 107个细胞。测定蛋白浓度。立即使用或−70 ºC保存。 注意： 1. 为保证获得完整的线粒体，第一是全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎  冰块中。第二是快速。微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的线粒体。第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。在相差显微镜下检查未裂解细胞应在~50%左右即可。过度研磨将破坏线粒体，研磨不足将降低得率。 2. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。 3. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入样品缓冲液裂解线粒体。 4. 细胞色素c氧化酶可用作线粒体的标志酶。