大型/大量质粒提取试剂盒   适用范围： 适用于大规模质粒制备和BAC/PAC大型质粒制备 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成 保存 20次 RNaseA（10mg/ml） -20℃ 1.3ml 溶液P1 4℃ 130ml 溶液P2 室温 100 ml 溶液PⅢ 室温 110 ml 杂质清除剂A 室温 3 ml 杂质清除剂B 室温 30 ml 内毒素清除剂 -20℃ 10 ml 本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。 储存事项: 1.第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml）置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会混杂有微量RNA残留，在溶液P1中补加RNase A即可。 2.内毒素清除剂在4℃可保存一个月，如果要长期保存，建议保存在－20℃! 3. 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 产品介绍： 本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA，采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂，只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质，获得高质量的质粒DNA。纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。纯化后期过程均在Eppendorf管中操作，方法简单，不需特殊设备，无需过柱，不用酚氯仿抽提；基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒，不必担心质粒DNA的丢失。本方法提取纯化质粒DNA，对质粒损伤小，即使是10kb甚至100kb以上的大型质粒或超大型BAC/PAC质粒，只要碱裂解法能够提取，就可以有效纯化。   产品特点： 1. 不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速、 方便、从100-140 ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.2-0.5mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80-90 %。 2. 获得的质粒产量高，超螺旋比例高，纯度好，可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 3.内毒素含量极低（<10 EU/μg DNA），可直接应用于细胞转染。 注意事项 1.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。 2.提取大质粒时操作动作要轻柔，应该使用剪大了开口的吸头，防止机械剪切对DNA的损坏。 3.DNA沉淀液沉淀离心后，可能看不到明显沉淀。如未见沉淀，担心DNA丢失，可保留上清液，待完成全部操作后电泳鉴定，以确定是否获得终产物（数百微克DNA离心沉淀在管的侧壁上，可能无法看到明显团块）。 4.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过95%。 5.质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道确切大小。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） ð提示：将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，使用后置于2-8℃保存。 1.取过夜培养菌<140 ml菌液，装入合适的离心瓶中，4,500~6,000 x g于4℃离心10 min沉淀菌体，完全弃除上清。 2. 加入5 ml 溶液P1，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。细菌悬液移入50 ml离心管中，室温放置3~5 min。   如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 3.加入5 ml 溶液P2，轻轻颠倒离心管6~8次，室温放置5 min，使细菌完全裂解，溶液透明。 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。 4. 加5 ml溶液PⅢ，立即颠倒离心管6~8次，充分混匀，至白色絮状物产生。冰上放置5-10分钟。上述裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g离心15 min，小心吸出上清，移入新的50 ml离心管中。 加入溶液PⅢ后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀，如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 5. 加入10 ml 异丙醇，颠倒离心管，充分混匀(可选：室温放置10 min)。 6. 于4℃ 12,000~16,000 x g离心10 min，小心弃去上清，倒置轻轻沥干残余液体，加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速离心5分钟，弃上清，晾干沉淀。 DNA沉淀如果干燥过头，DNA将无法完全，但是如果乙醇没有晾干挥发干净，残留太多，也会造成DNA无法完全溶解。 7.加入1.4 ml 溶液P1完全溶解沉淀团块（可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解）。移入新的1.5 ml离心管中，60℃水浴放置10~20 min。 8.最高速离心2分钟，取上清转入2个新的1.5 ml离心管中（每个700μl）。每管加入55μl杂质清除液A，颠倒充分混匀。 9. 加入约0.1体积(约80μl)冰预冷的内毒素清除剂到，颠倒旋转7-10次（30秒左右）充分混匀，冰浴或者冰上放置>=10分钟，中间偶尔颠倒混匀几次。 内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮。 10.42℃水浴，溶液又会变为浑浊，颠倒混匀后42℃温育5分钟。 11. 室温16,000 x g离心5-10 min分相（温度低时，内毒素清除剂无法分相，因此必须至少20°C以上室温离心）。 12.溶液必须分为上下两相，否则应重复步骤10-11。上层水相含DNA，下层油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到油状层），弃油状层。 下相体积较小，室温较高（如夏季）时候可能表现为混浊，和透明的上相分层明显，如果室温较低（如冬季），下相可能表现为透明的油状物质，和透明上相分层仅仅表现为界面的折光性不一致，应该仔细观察。 13.可选步骤: 根据对内毒素指标的要求重复抽提1-2次，即重复步骤9-12一两次，该步骤可以提高纯度，但是会损失一定量的质粒DNA，请根据具体需要选择使用。 14.将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B（约750μl），轻柔混匀后冰上放置10~30 min，4℃ 16,000 x g离心10 min，弃上清（注意不要丢失DNA），轻轻加入1 ml 70%乙醇洗涤，离心弃上清，共两次，室温倒置晾干5~10 min使乙醇完全挥发。 15.加适量TE（200~500μl）溶解沉淀（可在37℃水浴中振荡以辅助溶解）。要注意很多质粒DNA可能附着在离心管侧壁上，即使看不见，也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒DNA。