高纯度质粒大量快速提取试剂盒   适用范围： 适用于大规模高纯度质粒制备    试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成 保存 10次 RNaseA（10mg/ml） －20℃ 750µl 溶液P1 4℃ 75 ml 溶液P2 室温 75 ml 溶液P3 室温 110 ml 去蛋白液PD 室温 100 ml 漂洗液WB 室温 50 ml       第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温 20 ml 吸附柱DC 室温 10个 收集管（50ml） 室温 10个 本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。 储存事项: 1. 第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100μg/ml）置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液P1中补加RNase A即可。 2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。   产品介绍： 本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。   产品特点： 1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2. 不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速、方便，从100-200ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.2-0.5mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80 %左右。 3.获得的质粒产量高、超螺旋比例高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 注意事项 1.所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到至少6,000xg，带50ml转头的台式离心机。 2.溶液P3和去蛋白液PD中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。 3.提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液应在70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，提高提取效率。 4.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。 5.质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。 6.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱， 但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱，质粒应该保存－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱 （10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 提示： ð  第一次使用前请先在漂洗液WB瓶中加入200ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! ð  将RNase A全部加入溶液P1中，混匀。每次使用后置于2-8℃保存。 ð  将溶液P3放在冰上预冷。 1. 取100-200毫升过夜培养的菌液，6000xg，离心10分钟，尽可能的倒干上清，收集菌体。 收集超过50毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个50ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。 2. 用7ml溶液P1重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。   如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 3.加7ml的溶液P2，温和地上下翻转4 -7次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。 4.加10ml溶液P3，立即温和地上下翻转4 -7次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。冰上静置5-10分钟，4℃ ，至少2500xg离心20分钟(加大离心力可相应缩短离心时间,如15000xg离心10分钟)，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。 加入溶液P3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀，如果上清中还有飘浮白色沉淀，可再次离心后取上清。 5.可选,一般不需要:4℃，2500xg 再次离心10 分钟，小心取上清。 6.将上一步所得上清加入吸附柱DC中（吸附柱放入收集管中），静置2分钟，2500xg离心2分钟，倒掉收集管中的废液。 如果上清体积超过20ml，可以分多次过柱。 7. 加入10ml去蛋白液PD，2500xg离心2分钟，弃掉废液。 8. 加入10ml漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），2500xg离心2分钟，弃掉废液。 9.重复操作步骤8一次。 10.将吸附柱DC放回空收集管中，最高速（最好大于9000xg，如果离心机转速低，需要相应延长离心时间）离心10分钟以干燥膜基质残留乙醇，用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇，室温或者烘箱晾干几分钟。 该步骤目的为彻底去除吸附柱中残留乙醇，残留乙醇抑制下游反应并且严重降低洗脱效率，降低质粒产量。如果洗脱产量低，则必须加做步骤11。 11. 可选步骤: 选择以下两种方法之一干燥柱子： 1) 取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空15分钟； 2) 将柱子放置于60－65℃真空干燥箱或烘箱中，放置10-15分钟。 12.取出吸附柱DC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1-1.5ml洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好），室温放置2分钟，6000 xg离心5分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心2分钟。 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于1ml，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。