小量全血基因组DNA快速提取试剂盒
适用范围:
适用于快速提取全血基因组DNA
试剂盒组成、储存、稳定性:
试剂盒组成 |
保存 |
50次 |
100次 |
200次 |
缓冲液BB |
室温 |
10 ml |
20 ml |
40 ml |
结合液CB |
室温 |
15 ml |
30 ml |
60 ml |
抑制物去除液IR |
室温 |
25 ml |
50 ml |
100 ml |
漂洗液WB |
室温 |
15 ml 25 ml 50 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 |
洗脱缓冲液EB |
室温 |
15 ml |
15 ml |
15 ml x 2 |
蛋白酶K粉 (可选)20mg/ml |
-20℃ |
20mg |
40mg |
80mg |
吸附柱AC |
室温 |
50个 |
100个 |
200个 |
收集管(2ml) |
室温 |
50个 |
100个 |
200个 |
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:
1.结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2. 为避免降低活性,方便运输,提供蛋白酶K为冻干粉状,收到后,可短暂离心后,加入1毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性,因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存,-20℃保存。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍:
独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤, 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点:
1.不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
2. 快速,简捷,单个样品操作一般可在20分钟内完成。
3. 多次柱漂洗确保高纯度,典型的产量200µl全血可提取出3-6µg,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,长度可达30 kb -50kb,可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。
4.从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方,裂解快速完全,客户可根据需要选择购买。
5.典型的产量200µl全血可提取出3-6µg 基因组DNA。
6.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保批pH大于7.5, pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
注意事项:
1.所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.不同样品尤其疾病样品中白细胞数量差异可能非常大,因此产量的个体差异也可能非常大。
3.需要自备异丙醇。
4.开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。
5.为了最佳效果,最好使用新鲜血液标本或者4℃存放少于3天的标本,不要使用反复冻融超过3次的标本,否则会严重降低产量。
操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
1.取200ul新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液,放入1.5ml离心管。
如果全血起始量小于200μl,则用缓冲液BB补足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之间,则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μl-1ml之间,则需要先进行红细胞裂解操作(见本说明书后附录)。
2.加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液,充分混匀,再加入200μl结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,在70℃放置10分钟。溶液应变清亮(但颜色偏黑色)。
可选步骤,一般不需要: 如果RNA残留较多,需要去除RNA,可以在加入200μl 结合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液,振荡混匀,室温放置5-10分钟。
3.冷却后加入100μl 异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。
4.将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000 rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。
5. 加入500μl抑制物去除液IR,12,000 rpm 离心30秒,弃废液。
6. 加入700μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。
7.加入500μl漂洗液WB,12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。
8.将吸附柱AC放回空收集管中,13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9.取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好), 室温放置3-5分钟,12,000 rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000 rpm离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积不应少于50μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
10.DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
附录(以300μl,1ml全血举例红细胞裂解操作):
1.吸取900μl红细胞裂解液到一个1.5ml离心管或者3ml红细胞裂解液到一个15ml离心管。(红细胞裂解液可向本公司购买)
2.将抗凝全血(使用前回复到室温)颠倒混匀后,吸取300μl全血和1ml全血分别加到上述1.5ml和15ml离心管中,颠倒6-8次,并倒置轻弹管壁,确保充分混匀。
3.室温放置10分钟(期间应该颠倒轻弹混匀数次,帮助裂解红细胞)。
4.2,000 rpm离心20秒(对于1.5ml离心管)或2,000-3,000 rpm离心5分钟(对于15ml离心管),倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管底的细胞团),留下完整的管底白细胞团和大约10μl的残留上清。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团,也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起,但是如果看到的是大部分的红色细胞团,说明红细胞裂解很不充分,应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3,4。
5.加入200μl缓冲液BB涡旋振荡重悬白细胞团,充分分散白细胞团。
其中由于肝素抗凝血的白细胞沉淀团很难打散重悬,影响后续实验裂解效果,建议选用非肝素的抗凝剂收集血液标本。
6.现在可以按照操作步骤提取全血基因组DNA了。
7.问题与解决方法
问题 |
评论与建议 |
标本中 含有血凝块 |
*不恰当的存放标本,未充分混匀,未使用合适的抗凝剂-建议:丢弃有血凝块的标本,重新用EDTA,肝素,柠檬酸剂收集血液。 |
红细胞裂解 不完全 |
*血液标本裂解前没有回复到室温-建议:处理前先把血液标本回复到室温。
*裂解时间不够-建议:可延长裂解时间至15分钟以上。
*裂解过程中没有混匀-建议:裂解过程中可以更多次颠倒混匀,或者轻弹管壁帮助裂解。 |
DNA产量低 |
*血液标本中本身含有的白细胞数量低-建议:增加起始血液处理量。
*血液标本存放时间太长-建议:存放在4℃的血液标本超过5天的产量可能大大降低,因此不要存放太久。
*蛋白酶K失效了-建议:收到蛋白酶K后,按照每次使用量分装冻存,避免反复冻融。
*裂解不完全或者和异丙醇没有充分混匀-建议:加入结合液后,和加入蛋白酶K后立即吹打或者涡旋混匀;加入异丙醇后立即吹打或者涡旋混匀才加入吸附柱,如果太粘稠必须涡旋振荡15秒充分混匀。
*洗脱效率不高-建议:确保做了步骤8,否则残留乙醇会影响洗脱效率,仔细阅读仔细阅读注意事项6和步骤9和只使用洗脱缓冲液EB洗脱。 |
DNA下游酶切 不能切开或者 酶切不完全 |
*忘记做步骤8,乙醇抑制了酶切反应-建议:做步骤8,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。 |
DNA长度 小于15kb |
*血液样品太老或者不正确的存放,造成DNA降解-建议:选用新鲜的血液样品
*操作不当,造成对基因组DNA的剪切-建议:混匀时不可太剧烈,不可以用手剧烈振荡离心管,选用大口径的枪头转移或者混匀DNA。 |
A260吸光值 异常偏高 |
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了吸光值-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。 |
洗脱下来的 DNA溶液还带有轻微的颜色 |
*漂洗不完全-建议:1. 漂洗,直到离心下来的液体没有颜色;2. 将洗脱液当成起始材料,再重复一遍实验,注意略去蛋白酶K消化和70℃孵育步骤。 | |